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        操作指南

        ?茁彩生物通用样本处理方法

        2022-02-24

            

          血清

        全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融.

           血浆

        EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000g离心20分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

          组织匀浆

        用预冷的 PBS (0.01mol/L, pH=7.2-7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS(一般按 1:9 的重量体积比,比如 1g 的组织样品对应 9mL 的 PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于 5000×g 离心 5~10 分钟,取上清检测。

        培养的细胞

        A、动物细胞:用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液,使细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,收集细胞悬液,4℃低(3000rpm,5min),弃上清,加入一定量PBS200ul),轻轻吹打混匀,-20 冷冻30 min(液氮冷冻5min),37℃水浴解冻,如此反复3-5次,可形成细胞裂解液。 

        (如果反复冻融,破碎效果不好,就采用超声波破碎,破碎条件:用20kHz频率,150W的功率,在冰浴中进行超声波破碎,每破碎2s,间隔3s,反复破碎三次。),以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

        B、植物细胞:用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液,使细胞浓度达到100万/ml左右,置于冰盒上,用超声破碎仪,设置破碎2s,冷却30s的方式,充分破碎细胞,以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

        C、组织的细胞切割标本后,称取1g组织,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或匀浆器将标本匀浆充分。2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),去除上清,再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗涤沉淀的细胞三遍。再用上述的细胞破碎方法破碎细胞。

         植物标本
          (精提)

        1、 称取0.1g(误差±3%以内)新鲜植物组织样本,在液氮中充分研磨;

        2、 加入1ml的提取液(80%甲醇), 置于-20度过夜;

        3、 于4度,8000rpm,离心20分钟,取上清;

        4、 上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是: 80%甲醇(1ml)平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇(5ml)洗柱→100%乙醚(5ml)洗柱→100%甲醇(5ml)洗柱→循环。过柱后的样本真空干燥或氮气吹干,保存备用;

        5、 上样前加入pH7.4 PBS缓冲液(1ml定容);煸群笫椅路胖30分钟,然后4度离心(8000rpm,15分钟),取上清并暂时保存于4度待用。

         植物标本
          (推荐)

        用预冷的 PBS (0.01mol/L, pH=7.2-7.4)冲洗组织,去除残留物质(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS(一般按 1:9 的重量体积比,比如 1g 的组织样品对应 9mL 的 PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于 5000×g 离心 5~10 分钟,取上清检测。

           尿液

        用无菌管收集,2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

          胸腹水

        用无菌管收集,2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

          脑脊液

        用无菌管收集,2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

           牛奶

        用无菌管收集,2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

           蜂蜜

        用无菌管收集,2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

           土壤

        称取1g土壤,加入9ml的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工将标本充分混匀。2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清。

           粪便

        称取1g粪便,加入9ml的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工将标本充分混匀。2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清。

          咽拭子

        加入2ml的pH7.2-7.4左右的PBS,溶解咽拭子头部,摇匀,用镊子取出咽拭子并挤干液体,2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清。分装一份待检测,其余冷冻备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。如果是测分泌蛋白,直接取上清检测,测试细胞内蛋白,要破碎细胞。


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